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Smistamento cellulare

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Lo smistamento o selezione cellulare (Cell sorting) è il processo mediante il quale uno specifico tipo di cellula viene selezionato tra altri contenuti di un campione sulla base di proprietà fisiche o biologiche quali dimensioni, parametri morfologici, vitalità ed espressione proteica extracellulare e intracellulare. La popolazione cellulare omogenea che si ottiene è utile in varie applicazioni di ricerca, diagnosi e terapia[1].

Metodi

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I metodi di smistamento cellulare si dividono principalmente in due categorie: selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e selezione cellulare immunomagnetica.[2] Tuttavia, grazie a molti anni di perfezionamento e alla domanda in crescita, i ricercatori stanno lavorando allo sviluppo di dispositivi di smistamento microfluidico che presentano numerosi vantaggi rispetto alla tipica selezione cellulare.

Attivata dalla fluorescenza

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BERJAYA
Diagramma A: Selezione cellulare assistita da fluorescenza per la selezione negativa.

La selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), nota anche come smistamento cellulare mediante citometria a flusso, è un marchio registrato dalla Becton Dickinson and Company. Questa tecnica utilizza la citometria a flusso per smistare le cellule in base a parametri morfologici e all'espressione di diverse proteine extracellulari e intracellulari. Il metodo consente la separazione cellulare multiparametrica e prevede l'incapsulamento delle cellule in goccioline liquide che vengono selettivamente caricate elettricamente e separate mediante un campo elettrico esterno. La citometria a flusso si avvale di diversi sistemi che lavorano in sinergia per ottenere uno smistamento efficace per eventi di interesse. Sono inclusi sistemi fluidici, ottici ed elettrostatici. Il sistema fluidico deve stabilire un preciso distacco temporizzato dal flusso liquido in piccole gocce uniformi, così che le gocce contenenti singole cellule possano poi essere deflesse elettrostaticamente[3]. Secondo l'invenzione di Richard Sweet[4], la formazione di gocce del getto liquido di un separatore di cellule viene stabilizzata dalle vibrazioni di un trasduttore ultrasonico all'uscita. Le perturbazioni crescono esponenzialmente e portano alla frammentazione del getto in gocce con una temporizzazione precisa. Una cellula di interesse da selezionare verrà misurata nella zona di rilevamento e poi si sposterà lungo il flusso fino al punto di distacco. Durante la separazione della goccia con la cellula all'interno dal getto intatto, viene dato un impulso di tensione al getto liquido affinché le gocce contenenti le cellule di interesse possano essere deflesse nel campo elettrico creato tra le due piastre di deflessione per la selezione. Le gocce vengono quindi raccolte da tubi o vasche di raccolta posti sotto le piastre di deflessione. La citometria a flusso con selezione cellulare offre un'elevatissima specificità per uno o più marcatori di superficie, ma è limitata nel numero di cellule che possono essere processate durante una giornata lavorativa. Per questo motivo, spesso viene considerato il pre-arricchimento della popolazione di interesse mediante selezione cellulare immunomagnetica, soprattutto quando le cellule di interesse sono relativamente rare e si devono processare grandi lotti di cellule. Inoltre, i citometri a flusso con smistamento cellulare sono strumenti complessi che vengono generalmente utilizzati solo da personale ben addestrato in strutture di citometria a flusso o laboratori ben attrezzati e, poiché sono normalmente di grandi dimensioni, non è sempre possibile collocarli all'interno di una cappa di sicurezza biologica. Pertanto, non è sempre possibile garantire la sterilità del campione e, siccome i sistemi fluidici possono essere puliti ma non sono monouso, esiste la possibilità di contaminazione incrociata tra i campioni. Un altro aspetto da considerare è che, quando si utilizzano campioni infetti, la generazione di goccioline all'interno dello strumento potrebbe portare alla formazione di aerosol pericolosi per l'operatore. Queste ultime considerazioni sono di particolare importanza nelle applicazioni cliniche, come la terapia cellulare, che devono essere eseguite in conformità alle Norme di buona fabbricazione (GMP). I ricercatori hanno a disposizione una varietà di coloranti fluorescenti per progettare pannelli multicolore e ottenere separazioni simultanee ed efficaci di più tipi cellulari ben definiti. Il diagramma A mostra la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per la selezione negativa delle cellule (rimozione del gruppo indesiderato) e il diagramma B mostra la FACS per la selezione positiva delle cellule (selezione del gruppo desiderato).

BERJAYA
Diagramma B: Smistamento cellulare assistito da fluorescenza per la selezione positiva.

Coloranti fluorescenti nello smistamento cellulare

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I coloranti fluorescenti agiscono in modi diversi. Generalmente, un colorante fluorescente viene eccitato da una sorgente luminosa ad una certa lunghezza d'onda ed emette luce ad energia inferiore e lunghezza d'onda maggiore. I coloranti più comuni agiscono legandosi agli antigeni presenti sulle cellule. Gli antigeni bersaglio più comuni sono i Cluster di differenziazione (CD)[5]. Sono specifici per un certo tipo di cellula. Se si identifica il CD presente sulle cellule di interesse, è possibile colorare il campione con un colorante fluorescente specifico e utilizzare la citometria a flusso per separare la popolazione di interesse. I coloranti fluorescenti possono agire tramite svariati meccanismi.

Alcuni coloranti sono in grado di diffondersi attraverso la membrana cellulare. Sfruttando questa proprietà, è possibile caratterizzare l'attività intracellulare e l'espressione superficiale delle proteine. Ad esempio, nelle cellule morte, lo ioduro di propidio (PI) può penetrare nel nucleo e legarsi al DNA. Il segnale di fluorescenza del PI può essere utilizzato per quantificare il contenuto di DNA ai fini dell'analisi del ciclo cellulare o per identificare cellule morte in un campione.

Alcuni coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per caratterizzare l'attività cinetica intracellulare senza fissare le cellule in formaldeide, con conseguente perdita di cellule vitali.

La tabella seguente elenca i coloranti che possono essere utilizzati per misurare diversi parametri di citotossicità da stress ossidativo.

Colorante Parametro Meccanismo d'azione Eccitazione/Emissione
DCFH-DA Specie reattive dell'ossigeno

(ROS)

 Deacetilato

in 2,7-diclorofluoresceina, che in presenza di radicali reagisce con i ROS trasformandosi in 2,7-diclorofluoresceina (DCF)

 488 nm/525 nm
Rh123 Potenziale di membrana mitocondriale

(MMP)

 Viene sequestrato dai mitocondri attivi 488 nm/525 nm
Indo-1 AM Concentrazione di calcio Emette a due diverse lunghezze d'onda in base alla presenza di ioni calcio 350 nm/[400 nm/485 nm]
PI Cellule vive o morte Penetra solo le cellule morte e si lega al DNA 488 nm/675 nm

Questo tipo di esperimento è solo un esempio delle potenzialità della citometria a flusso. Nei sistemi FACS, le cellule caratterizzate possono poi essere selezionate e purificate per ulteriori esperimenti.

Selezione immunomagnetica delle cellule

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MACS

La selezione cellulare immunomagnetica, è nota anche come arricchimento cellulare immunomagnetico o selezione cellulare attivata magneticamente, generalmente detta MACS, marchio registrato di Miltenyi GmbH. Si basa sullo smistamento di microsfere che attraversano un campo magnetico. Diverse aziende offrono soluzioni differenti per l'arricchimento o la deplezione di popolazioni cellulari. La selezione cellulare immunomagnetica fornisce un metodo per arricchire una miscela eterogenea di cellule in base all'espressione delle proteine di superficie (antigeni). Si basa sul legame di piccole particelle supermagnetiche inerti ad anticorpi monoclonali (mAb) specifici per gli antigeni presenti sulla popolazione cellulare target. Le cellule marcate con i coniugati anticorpo-microsfera vengono quindi separate attraverso una colonna di separazione immersa in un campo magnetico. Le microsfere aderiscono alla matrice all'interno della colonna e le cellule che trasportano vengono trattenute. Le cellule non marcate riescono ad attraversare il campo e vengono raccolte nel flusso di eluizione. Per eluire le cellule intrappolate dalla colonna, il campo magnetico viene semplicemente rimosso. La separazione cellulare immunomagnetica consente quindi diverse strategie per arricchimento e deplezione delle cellule.[3] Le microsfere immunomagnetiche di solito non interferiscono con i test successivi, tuttavia per alcune applicazioni potrebbe essere necessario rimuoverle. Con questo metodo, aumentare il numero di cellule non influisce significativamente sui tempi di elaborazione e si riesce a garantire la sterilità del campione eseguendo la selezione all'interno di una cappa di biosicurezza. D'altra parte, questa tecnica consente di separare le cellule in base a un solo marcatore e non riesce a discriminare tra diversi livelli di espressione proteica per un'analisi quantitativa. La selezione cellulare immunomagnetica si è dimostrata vantaggiosa in particolare con colture di cellule progenitrici neurali (NPC), poiché è più facile da gestire e causa meno danni alle cellule vive.[6]

Le colture di NPC sono particolarmente difficili da gestire perché le cellule cerebrali vive sono sensibili e tendono a contaminarsi a vicenda.[6] Per risultati più chiari, i laboratori necessitano di linee di NPC più pure.[6] Uno studio condotto nel 2019 (con il supporto finanziario della New York Stem Cell Foundation e dell'Association for Frontotemporal Degeneration) ha scoperto che la selezione cellulare immunomagnetica è un modo economico e semplice per ottenere tale purezza causando danni minimi alle linee cellulari, per mantenere cellule di migliore qualità, raccogliere NPC più omogenee e aumentare le possibilità di trovare trattamenti efficaci per i disturbi neurologici.[6] Hanno utilizzato sia il metodo immunomagnetico che quello attivato dalla fluorescenza per filtrare CD271 - (marcatori utili per le cellule staminali mesenchimali) e CD133+ (marcatori per le cellule staminali tumorali) per confrontare la vitalità in ciascun metodo.[6]

La selezione cellulare immunomagnetica è stata utilizzata anche nell'assistenza alla riproduzione (inseminazione artificiale) e nel trattamento del trapianto di retina.[7][8] Nel caso dell'assistenza alla riproduzione, gli spermatozoi apoptotici (cellule morte o danneggiate) vengono separati in modo da raccogliere ed utilizzare più spermatozoi non apoptotici (non danneggiate) e aumentare la probabilità di fertilità del soggetto.[7] Questo tipo di trattamento si è dimostrato più efficace se eseguito ripetutamente, aumentando la quantità di cellule non apoptotiche presenti durante l'inseminazione.[7]

Uno studio del 2018 condotto in Francia (con il supporto di numerosi individui e agenzie, tra cui: l' Institut de la Vision di Parigi e l'associazione Retina France) ha utilizzato i ratti e il metodo di selezione cellulare immunomagnetica per dimostrare che i fotorecettori (cellule della retina che rispondono alla luce) possono essere trapiantati per curare la cecità.[8] In questo processo, le microsfere sono state attaccate all'enzima CD73 per facilitare la separazione dei PR (fotorecettori) dagli organoidi retinici.[8] L'antigene CD73+ espresso con cellule RCVRN+ (proteine che si legano al calcio nell'occhio) ha mostrato ai ricercatori che questa combinazione di CD73+ e RCVRN+ poteva essere utilizzata con precursore post-mitotico dei PR per la riparazione.[8] Sebbene lo studio non ne abbia potuto verificare il successo negli esseri umani, con l'abbinamento di successo di fotorecettori non danneggiati con l'antigene CD73, e il trapianto nei ratti, si sono poste le basi per ulteriori ricerche.[8] Questo successo nella selezione e nell'accoppiamento cellulare tramite trapianto mostra promettenti prospettive per una potenziale cura delle malattie della retina, anche per la cecità totale. Ad oggi, è stata riportata solo una riparazione parziale della vista.[8]

Dispositivi microfluidici

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Per superare le varie limitazioni della selezione cellulare con fluorescenza e immunomagnetica, è stata sviluppata un'ampia gamma di dispositivi di smistamento cellulare microfluidico. Alcuni sono già disponibili in commercio o in fase di sviluppo commerciale. La ricerca sulla progettazione di dispositivi per lo smistamento cellulare microfluidico spesso impiega tecniche di litografia morbida che utilizza materiali come il polidimetilsilossano (PDMS).

Un vantaggio fondamentale dei selezionatori microfluidici è la possibilità di eseguire la separazione con citometria a flusso (FACS) utilizzando cartucce sterili monouso sigillate, le quali non permettendo l'esposizione dell'operatore ai rischi biologici delle goccioline emesse dai sistemi FACS. Altri vantaggi sono dovuti alla riduzione dello stress idrodinamico a cui vengono sottoposte le cellule che riduce l'impatto sulla loro vitalità. Alcuni dispositivi pubblicati mostrano potenziale per la separazione multidirezionale, la riduzione dei costi per le cartucce grazie a metodi di produzione a basso costo, meno consumi e dimensioni ridotte (alcuni dispositivi hanno le dimensioni di una carta di credito). Alcuni hanno raggiunto risultati ad alta purezza e velocità fino a circa 50.000 cellule/s.[9][10][11][12]

Gli smistatori cellulari microfluidici possono essere suddivisi in due categorie: attivi e passivi. I dispositivi attivi deviano le singole cellule secondo misurazioni citometriche effettuate in tempo reale. I dispositivi passivi sfruttano le differenze fisiche tra le cellule, nel modo in cui interagiscono con il flusso del fluido o con le superfici.

Attivi

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I selezionatori cellulari microfluidici attivi basano la deviazione delle singole cellule sulla loro misurazione mediante metodi citometrici come marcatura fluorescente, diffusione della luce e analisi delle immagini. Le singole cellule vengono deviate da una forza applicata direttamente su di esse o dal fluido circostante, e fluiscono nei contenitori di uscita separati.

I metodi di deviazione cellulare utilizzano diversi tipi di attuatori macroscopici, ottici o MEMS (sistemi micro-elettro-meccanici) per deviare una particella o un volume di liquido all'interno di un microcanale. Alcuni esempi recenti di rilievo si basano su attuatori a onde acustiche di superficie[13][14][15][16][17][18], attuatori macroscopici (come gli attuatori piezoelettrici) accoppiati a microcanali[19][20][21][22], dielettroforesi di goccioline[23], attuatori a bolle di vapore termico[24][25][26][27][28], microvortici transitori generati da attuatori a bolle di vapore termico[29], manipolazione ottica[30] e valvole micromeccaniche. I più veloci tra questi hanno dimostrato velocità di selezione superiori a 1.000/s e, in alcuni casi, velocità di elaborazioni potenzialmente massime, vicine a quelle della FACS[31][32][33][34][35][36]. La selezione cellulare microfluidica attiva richiede strumentazione citometrica simile a quella della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza descritta sopra[37].

I selezionatori cellulari microfluidici attivi hanno il potenziale per adattarsi al volume di produzione grazie alla parallelizzazione su chip[38]. Il dispositivo di selezione microfluidica attivo più veloce pubblicato ha dimostrato una produttività di 160.000/s [39]

Passivi

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La selezione cellulare passiva utilizza il comportamento del fluido all'interno dei microcanali per modificare e smistare le cellule in base alle dimensioni e alla morfologia[40]. Il fluido in una soluzione colloidale è soggetto a un certo profilo di velocità a causa delle interazioni del fluido con le pareti del canale; le cellule in soluzione sono soggette a varie forze di trascinamento e inerziali che dipendono dalle dimensioni della cellula e si bilanciano di conseguenza in diverse posizioni lungo il profilo di velocità[41]. Nei canali microfluidici curvi, si formano vortici a causa della forza di Dean che posizionano le particelle di diverse dimensioni in diverse posizioni della sezione trasversale, per numero di Reynolds e raggio di curvatura[42].

Ad esempio, in un canale rettilineo, le cellule più grandi in soluzione colloidale si trovano più al centro del microcanale rispetto alle cellule più piccole, a causa delle maggiori forze di trascinamento della parete che spingono la cellula lontano, e della forza del gradiente di taglio del profilo di velocità che bilancia la forza di trascinamento della parete e porta la cellula in equilibrio[43].

Altri metodi di smistamento cellulare che utilizzano anticorpi

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Prima che la selezione cellulare basata su fluorescenza e immunomagnetica acquisissero popolarità sono stati applicati diversi metodi di selezione e arricchimento cellulare mediante anticorpi[44]. Tra questi figuravano la selezione cellulare mediata da anticorpi e sistemi di complemento, i dispositivi di immunoaffinità in polistirene e il sistema CellPro CEPRATE® SC che immobilizza gli anticorpi in una colonna porosa. Quest'ultimo è stato il primo dispositivo medico approvato dalla FDA per la selezione delle cellule staminali ematopoietiche.

Una tecnica di selezione cellulare più recente che impiega anticorpi è quella che sfrutta il galleggiamento (BACS), in cui le microbolle si legano alle cellule attraverso anticorpi che si legano alla superficie delle cellule. Le cellule bersaglio vengono quindi rimosse da un campione biologico tramite flottazione.[45]

Smistamento di singole cellule

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La separazione di singole cellule fornisce un metodo per smistare una miscela eterogenea di cellule in base alle loro proprietà intracellulari ed extracellulari. Separare le singole cellule permette di comprendere proprietà cellulari che potrebbero essere nascoste o non evidenti. Esistono diversi metodi di smistamento delle singole cellule:

L'array microraft fornisce un metodo rapido ed economico per l'isolamento, l'analisi nel tempo e la generazione di popolazioni clonali, con la capacità unica di monitorare tutte le proprietà intra- ed extracellulari.[46] Questo sistema è ideale sia per i tipi di cellule ancorate che in sospensione.

È stato studiato un metodo a singola cellula per osservare la risposta a uno stimolo esterno (in questo caso, la risposta cellulare a un ligando) utilizzando un dispositivo microfluidico con valvole a microcanali per intrappolare una singola cellula in una camera. È stato utilizzato un sistema a 23 valvole e, nell'imaging stimolo-risposta, un colorante fluorescente[47].

I metodi di clustering a singola cellula si riferiscono ad una serie di metodi statistici progettati da data scientist che si basano sulle proprietà intracellulari. Il processo include la raccolta di dati RNA-Seq a singola cellula, la preelaborazione dei dati per il clustering, il clustering e la valutazione dei cluster. Gli scienziati applicano metodi di apprendimento automatico (principalmente analisi di clustering) sui dati RNA-Seq a singola cellula per dividere le cellule in diverse categorie. I vari metodi vengono adattati per risolvere problemi nei dati RNA-Seq come la perdita di geni a bassa espressione e marcatori cellulari ambigui in presenza di errori di natura tecnica. Tra i metodi all'avanguardia troviamo SC3, [48] CIDR, [49] Seurat.

Note

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  1. ↑ (EN) Steven A Soper, Cell Separations and Sorting, in Anal Chem, vol. 92, 7 gennaio 2020, pp. 105–131, DOI:10.1021/acs.analchem.9b05357, PMID 31808677.
  2. ↑ (EN) Arturo Zychlinsky, Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition), in Eur J Immunol, vol. 49, ottobre 2019, pp. 1457–1973, DOI:10.1002/eji.201970107, PMID 31633216.
  3. 1 2 (EN) Arturo Zychlinsky, Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition), in Eur J Immunol, vol. 49, ottobre 2019, pp. 1457–1973, DOI:10.1002/eji.201970107, PMID 31633216.
  4. ↑ (EN) Richard G Sweet, Fluid droplet recorder, su patents.google.com.
  5. ↑ (EN) Human CD & Other Cellular Antigens - US, su www.thermofisher.com. URL consultato l'11 dicembre 2018.
  6. 1 2 3 4 5 (EN) Alison M. Goate, Reduced variability of neural progenitor cells and improved purity of neuronal cultures using magnetic activated cell sorting, in PLOS ONE, vol. 14, 27 marzo 2019, DOI:10.1371/journal.pone.0213374, PMID 30917153.
  7. 1 2 3 (EN) Magnetic-Activated Cell Sorting of Human Spermatozoa, DOI:10.1007/978-1-4419-1780-5_29.
  8. 1 2 3 4 5 6 (EN) Gagliardi, Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids, in Stem Cell Reports, vol. 11, settembre 2018, pp. 665–680, DOI:10.1016/j.stemcr.2018.07.005, PMID 30100409.
  9. ↑ (EN) Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems, in Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 397, agosto 2010, pp. 3249–67, DOI:10.1007/s00216-010-3721-9, PMID 20419490.
  10. ↑ (EN) Purification of regulatory T cells with the use of a fully enclosed high-speed microfluidic system, in Cytotherapy, vol. 16, ottobre 2014, pp. 1384–9, DOI:10.1016/j.jcyt.2014.05.016, PMID 25065635.
  11. ↑ (EN) Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation, in Lab on a Chip, vol. 15, marzo 2015, pp. 1230–49, DOI:10.1039/C4LC01246A, PMID 25598308.
  12. ↑ (EN) Standing surface acoustic wave (SSAW) based multichannel cell sorting, in Lab on a Chip, vol. 12, novembre 2012, pp. 4228–31, DOI:10.1039/C2LC40751E, PMID 22992833.
  13. ↑ (EN) X. Ding et al., Standing surface acoustic wave (SSAW) based multichannel cell sorting, in Lab on a Chip, vol. 12, n. 21, novembre 2012, pp. 4228–31, DOI:10.1039/c2lc40751e, PMC 3956451, PMID 22992833.
  14. ↑ (EN) L. Schmid, D.A. Weitz e T. Franke, Sorting drops and cells with acoustics: acoustic microfluidic fluorescence-activated cell sorter, in Lab on a Chip, vol. 14, n. 19, 7 ottobre 2014, pp. 3710–3718, DOI:10.1039/c4lc00588k, ISSN 1473-0189 (WC · ACNP), PMID 25031157.
  15. ↑ (EN) Z. Ma, Y. Zhou, D.J. Collins e Y. Ai, Fluorescence activated cell sorting via a focused traveling surface acoustic beam, in Lab on a Chip, vol. 17, n. 18, 12 settembre 2017, pp. 3176–3185, DOI:10.1039/C7LC00678K, ISSN 1473-0189 (WC · ACNP), PMID 28815231.
  16. ↑ (EN) L. Ren et al., A high-throughput acoustic cell sorter, in Lab on a Chip, vol. 15, n. 19, 7 ottobre 2015, pp. 3870–3879, DOI:10.1039/c5lc00706b, ISSN 1473-0189 (WC · ACNP), PMC 4641751, PMID 26289231.
  17. ↑ (EN) L. Schmid, D.A. Weitz e T. Franke, Sorting drops and cells with acoustics: acoustic microfluidic fluorescence-activated cell sorter, in Lab on a Chip, vol. 14, n. 19, ottobre 2014, pp. 3710–8, DOI:10.1039/c4lc00588k, PMID 25031157.
  18. ↑ (EN) L. Ren et al., A high-throughput acoustic cell sorter, in Lab on a Chip, vol. 15, n. 19, ottobre 2015, pp. 3870–3879, DOI:10.1039/c5lc00706b, PMC 4641751, PMID 26289231.
  19. ↑ (EN) S.H. Cho, C.H. Chen, F.S. Tsai, J.M. Godin e Y. -H. Lo, Human mammalian cell sorting using a highly integrated micro-fabricated fluorescence-activated cell sorter (μFACS), in Lab on a Chip, vol. 10, n. 12, 21 giugno 2010, pp. 1567–1573, DOI:10.1039/c000136h, ISSN 1473-0197 (WC · ACNP), PMC 3118392, PMID 20379604.
  20. ↑ (EN) C. Lee et al., Microfluidic droplet sorting with a high frequency ultrasound beam, in Lab on a Chip, vol. 12, n. 15, 7 agosto 2012, pp. 2736–2742, DOI:10.1039/c2lc21123h, ISSN 1473-0189 (WC · ACNP), PMC 3400154, PMID 22643737.
  21. ↑ (EN) R. Hulspas et al., Purification of regulatory T cells with the use of a fully enclosed high-speed microfluidic system, in Cytotherapy, vol. 16, n. 10, ottobre 2014, pp. 1384–1389, DOI:10.1016/j.jcyt.2014.05.016, ISSN 1465-3249 (WC · ACNP), PMID 25065635.
  22. ↑ (EN) S.H. Cho, C.H. Chen, F.S. Tsai, J.M. Godin e Y.H. Lo, Human mammalian cell sorting using a highly integrated micro-fabricated fluorescence-activated cell sorter (microFACS), in Lab on a Chip, vol. 10, n. 12, giugno 2010, pp. 1567–73, DOI:10.1039/c000136h, PMC 3118392, PMID 20379604.
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  30. ↑ (EN) Y. Chen et al., Pulsed laser activated cell sorting with three dimensional sheathless inertial focusing, in Small, vol. 10, n. 9, maggio 2014, pp. 1746–51, DOI:10.1002/smll.201302885, PMC 4324602, PMID 24536017.
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